注意事項：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
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實驗過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
Platinum tetraiodide鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液1.50mg/L,質(zhì)標(biāo)樣2-羥并咪唑  97%

Platinum(IV) oxide鈉 CP,98.0%3,9-二(1, 1-二甲基-2-羥基乙基)-2,4,8,10-氧代螺旋[5.5]十一烷

Cadmium溴烯, 包含≤1000 ppm 氧化烯穩(wěn)定劑, 98%(±)-3-羥基-r-丁內(nèi)酯 96%

Cadmium1-溴戊烷 GR，99%鹽酸倍他司汀 99%

Cadmium bromide溴代十四烷 98%2-氯芐 99%

Cadmium carbonate1-溴代正己烷 99%6-氯-7-氮雜嘌呤 98%

Cadmium hydroxide溴代正丁烷 CP,98%乙酸乙酯 98%

Cadmium iodide1-溴代正辛烷 98%二乙氧基乙酸乙酯 97%

Cadmium sulfide1-溴-3-氯烷 99%3-甲酰基-2-酸乙酯 97%

Cadmium acetate dihydrate溴代異丁烷 98%4-噁唑羧酸乙酯 97%

N-Acetylphenylhydrazine溴代叔丁烷, 包含0.5%碳酸穩(wěn)定劑, CP乙二楊酸酯 98%

Hydrazine dihydrochloride溴代叔丁烷  >98.0%(GC)乙酸乙酯,甲苯溶液 50%甲苯溶液

Hydrazine mohydrochloride溴代正壬烷 97%羥基乙酰胺 98%

3-Hydroxy-2-naphthoic hydrazide溴代正癸烷 AR，98%乙酸 98%

Phenylhydrazine溴代十二烷 98%乙酸甲酯 98%

Antimony1-溴十八烷 97%二甲氧基乙酸甲酯 97%

二氯二茂鋯(>97.0%(T))IL-17A (D1X7L) Rabbit mAb (Mouse Specific) (PE Conjugate)IRS-3  胰島素受體底物-3抗體

Chirabite-AR[用于核磁共振]MRP3/ABCC3 (D8V8J) Rabbit mAbIRS-2  胰島素受體底物-2抗體

三(2,2,6,6-四甲基-3,5-庚二酮酸)鐠(III)(＞98%(T))Tuberin/TSC2 (D57A9) Rabbit mAbIRS1  胰島素受體底物-1抗體

三(2,2,6,6-四甲基-3,5-庚二酮酸)銪(III)(＞95%(T))FABP5 (D1A7T) Rabbit mAbIRS P53  胰島素受體底物p53蛋白抗體

三(6,6,7,7,8,8,8-七氟-2,2-二甲基-3,5-辛二酮基)鐠(Ⅲ)(>97.0%(T))FABP5 (D1A7T) Rabbit mAbIroquois homeobox protein 3  Irx3蛋白抗體

(S)-(+)-1,1'-聯(lián)萘基-2,2'-雙磷酸氫酯(>97.0%(T))Gα (pan) AntibodyIRGM  免疫相關(guān)鳥苷三磷酸酶基因抗體

(R,R)-(-)-2,3-丁二(>96.0%(GC))MAVS AntibodyIRF7  干擾素調(diào)節(jié)因子7抗體

(S,S)-(+)-2,3-丁二(>97.0%(GC))MAVS AntibodyIRF4  干擾素調(diào)節(jié)因子4抗體

(+)-芐甲苯基硅基乙酸(>98.0%(T))MSH6 (P150) AntibodyIRF3  干擾素調(diào)節(jié)因子3

(-)-芐甲苯基硅基乙酸(>98.0%(T))MSH6 (P150) AntibodyIRF-1/MAR1  干擾素調(diào)節(jié)因子1抗體
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檢測步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個反應(yīng)加入的量 N個反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。