注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
?
實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
Lauric acidN-芐氧羰基-L-脯氨酸 98%5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物 97%

TMEDACBZ-L-賴氨酸 98%N-對(duì)甲苯磺酰甘氨酸 98%

Glutaric acidCbz-L-脯氨酸酰胺 98%阿斯巴甜 98%

Succinic acidZ-D-Asp(OtBu)-OH·H2O 98%N-乙酰-D-氨基葡萄糖 98%

Sodium succinate dibasicN-芐氧羰基-L-氨酸 98%N-乙酰-D-氨基葡萄糖 97%

Ammonium succinateN-芐氧羰基-L-色氨酸 98%N-乙酰-D-氨基葡萄糖 細(xì)胞培養(yǎng)級(jí),≥98%

Adipic acidN-芐氧羰基-L-谷氨酸γ-叔丁酯 99.0%甲殼素 practical grade

Azelaic acidN-CBZ-D-色氨酸 98%殼聚糖  脫乙酰度≥95%, ,粘度100-200 mpa.s

meso-2,3-DibromosuccinicN-芐氧羰基-L-天冬酰胺 99%羧化殼聚糖 BR,溶性

Malonic acidN-芐氧羰基-甘氨酸 98%殼聚糖 低粘度：<200 mPa.s

Sodium malonate mohydrateN-芐氧羰基-L-甲硫氨酸 98%殼聚糖 中粘度200-400 mPa.s

Sodium malonateN-CBZ-beta-氨酸 98%殼聚糖 高粘度>400 mPa.s

Sodium propionateN-CBZ-D-苯氨酸 98%2-脫氧-D-葡萄糖 98%

Sebacic acidN-CBZ-D-脯氨酸 98%D（+）-氨基葡萄糖鹽酸鹽 ≥99%

Suberic acidN-芐氧羰基-L-酪氨酸 98%D（+）-氨基葡萄糖鹽酸鹽 分析標(biāo)準(zhǔn)品

Kojic acidCbz-D-賴氨酸  98%苯甲 AR,99%

二環(huán)己胺(分析標(biāo)準(zhǔn)品,>99.5%(GC))DNMT3A (D23G1) Rabbit mAbMAP4K6/MINK1  絲裂原活化蛋白激酶MAP4K6抗體

二苯并噻吩(標(biāo)準(zhǔn)品)SimpleChIP® Human NRIP1 Upstream PrimersMAP4K4  絲裂原活化蛋白激酶MAP4K4抗體

9,10-二苯基蒽(標(biāo)準(zhǔn)品)EpCAM AntibodyMAP4K1  造血祖細(xì)胞激酶1抗體

反式-1,2-二氯乙烯(標(biāo)準(zhǔn)品)Phospho-BLNK (Tyr96) AntibodyMAP4  微管相關(guān)蛋白4抗體

3,4-二氨苯(標(biāo)準(zhǔn)品)Phospho-BLNK (Tyr96) AntibodyMAP3K9  絲裂原活化蛋白激酶3K9抗體

2,3-二氯苯酚(標(biāo)準(zhǔn)品)Cdc7 AntibodyMAP3K8/TPL2  絲裂原活化蛋白激酶激酶8抗體

2,5-二氯苯酚(標(biāo)準(zhǔn)品)CDC37 (V367) AntibodyMAP3K7IP3  NFKB激活蛋白1抗體

3,4-二氯苯酚(標(biāo)準(zhǔn)品)SNAT1/SLC38A1 (D9L2P) Rabbit mAbMAP3K7IP1/TAB1  轉(zhuǎn)化生長因子β活化激酶結(jié)合蛋白1抗體

3,5-二氯苯酚(標(biāo)準(zhǔn)品)DIDO1 AntibodyMAP3K5/ASK1/MEKK5  細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1抗體

對(duì)苯二甲酸二甲酯(標(biāo)準(zhǔn)品)RanGAP1 (D2T7T) Rabbit mAbMAP3K2/MEKK2  絲裂原活化蛋白激酶激酶2抗體
巴西果仁PCR檢測(cè)試劑盒廠家B淋巴細(xì)胞淋巴瘤因子9抗體5,7,4'-Tri-O-methylcatechin中文名：別名：分子式：C18H20O6

腫瘤轉(zhuǎn)移抑制蛋白BAMBI抗體7-O-Methylporiol中文名：別名：分子式：C17H16O5

β淀粉樣肽（1-42）單克隆抗體Dodoviscin J中文名：別名：分子式：C22H22O7

膽汁酸鹽輸出泵/ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白11抗體Kuwal C中文名：別名：分子式：C25H26O6

程序性死亡配體1抗體Hesperetin 5-O-glucoside中文名：別名：分子式：C22H24O11
檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。