注意事項：1．基礎(chǔ)程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應動力學；8．PCR擴增產(chǎn)物；9．PCR反應體系與反應條件。

組成及試劑配制:
1、酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
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實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行設立一個的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開，并且要充分混勻。
Beryllon I茚三酮，合 AR,95.0%硫酸 CP，98.5%

Beryllon II茚三酮，合 ACS reagent, ≥98.0% (UV)鹽酸苯甲脒，合 98%

Graphite powder5-硝基 98%4-氯苯甲 99.0%

Permutit4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并氧雜惡二唑 99%4-苯甲 97%

Soda lime4-硝基-7-哌苯并氧雜惡二唑 98%1-氨基茚滿  98%

Sea sand4-肼基-7-硝基-2,1,3-苯并氧雜惡二唑 98%楊 98%

Lipofectamine 2000 Transfection Reagent1,4-哌二乙磺酸 99%1-氨基茚滿  98%

Cinchonine哌-N,N-雙(2-羥基烷磺酸) 99%鹽酸阿霉素 98%

Rhodanine苯甲≥98.5% (GC)(R)-(+)-2,2'-雙(二苯膦基)-1,1'-聯(lián)萘 98%

Diethyl oxalate對二甲苯二聚體 99%(S)-(-)-2,2'-雙(二苯膦基)-1,1'-聯(lián)萘 98%

Iodine對磷酸二鈉 98%(±)-2,2'-雙-(二苯膦基)-1,1'-聯(lián)萘 98%

Chinese red5’-磷酸吡哆,一 98%(R)-(-)-1,1'-聯(lián)-2-萘酚二(三氟甲磺酸酯)  98%

Bentonite鹽酸吡哆 99%1,1'-聯(lián)萘酚-2,2'-雙(三氟磺酸酯)  98%

Boron carbide1,4-哌二乙磺酸二鈉鹽 BC二苯基膦 95%

Boron oxide1,4-哌二乙磺酸倍半鈉鹽 99%(R)-(-)-5,5'-雙[二(3,5-二叔丁基-4-甲氧基苯基)磷]-4,4'-二-1,3

Glass Fiber并五苯 98%(S)-DTBM-SEGPHOS 98%

染料木素/金雀異黃酮ETS-1 (D8O8A) Rabbit mAbPPM1B  蛋白質(zhì)磷酸酶1B抗體（PP2Cβ）

染料木素/金雀異黃酮(標準品）Cleaved Caspase-8 (Asp387) (D5B2) XP® Rabbit mAb (Mouse Specific) (PE Conjugate)PPIL1  親環(huán)素相關(guān)蛋白1抗體

酚YAP (D8H1X) XP® Rabbit mAbPPIG  親環(huán)蛋白（親環(huán)素）PPIG抗體

酚(標準品)YAP (D8H1X) XP® Rabbit mAbPPIB/Cyclophilin B  親環(huán)蛋白（親環(huán)素）PPIB抗體

木犀草素SYAP1/BSTA AntibodyPPIA/Cyclophilin A  親環(huán)蛋白（親環(huán)素）PPIA抗體

木犀草素（標準品）LC3A/B (D3U4C) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 594 Conjugate)PPHLN1  脈周蛋白1抗體（胃癌抗原蛋白Ga50）

熊果酸SimpleChIP® Human RNU2-1 Promoter PrimersPPARGC1A/PGC1 α  過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活子1α抗體

熊果酸；烏蘇酸(標準品)PHB2 (E1Z5A) Rabbit mAbPPAR-delta/beta  D型-過氧化酶活化增生受體抗體

香葉木素CdGAP (D6J9G) Rabbit mAbPPAR Gamma  過氧化酶活化增生受體γ抗體

香葉木素（標準品）APC11 (D1E7Q) Rabbit mAbPPAR gamma  過氧化酶活化增生受體γ抗體
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檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應體系配制如下表：
試劑 每個反應加入的量 N個反應加入的量
熒光PCR反應液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。